Полногеномная амплификация малых количеств ДНК для определения молекулярного кариотипа клеток

Авторы

  • Алсу Фаритовна Сайфитдинова Российский государственный педагогический университет им. А. И. Герцена; Международный центр репродуктивной медицины https://orcid.org/0000-0002-1221-479X
  • Ольга Андреевна Павлова Международный центр репродуктивной медицины; ООО «Бигль» https://orcid.org/0000-0001-9488-6903
  • Андрей Андреевич Зелинский Санкт-Петербургский государственный университет https://orcid.org/0000-0003-2068-3024
  • Марина Владиславовна Рябинина Санкт-Петербургский государственный университет https://orcid.org/0000-0002-5504-7362
  • Олег Сергеевич Глотов Детский научно-клинический центр инфекционных болезней Федерального медико-биологического агентства России; ООО «Сербалаб»; Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д. О. Отта https://orcid.org/0000-0002-0091-2224
  • Денис Игоревич Богомаз ООО «Бигль»; Институт биомедицинских систем и биотехнологии Санкт-Петербургского политехнического университета Петра Великого https://orcid.org/0000-0002-6536-3465
  • Александр Анатольевич Рубель Санкт-Петербургский государственный университет https://orcid.org/0000-0001-6203-2006

DOI:

https://doi.org/10.33910/2687-1270-2023-4-3-324-334

Ключевые слова:

вырожденные праймеры, амплификация с множественным вытеснением цепи, полимеразная цепная реакция (ПЦР), секвенирование ДНК отдельных клеток, изменение числа копий участков генома, молекулярный кариотип

Аннотация

Задача равномерного масштабирования предельно малых количеств ДНК из отдельных клеток для молекулярно-генетических исследований потребовала разработки специализированных методов. За 30 лет были предложены разные подходы, базирующиеся на использовании вырожденных праймеров. Однако ограничение методов определяется также свойствами используемых полимераз. В настоящем исследовании предложено использование двухступенчатой полногеномной амплификации для получения надежных данных о молекулярном кариотипе исходного образца на основе анализа 20 пикограммов (пг) ДНК. В протоколе на первом этапе фланкирования фрагментов ДНК и амплификации с вытеснением второй цепи была использована пара частично вырожденных праймеров: 5’-TGTGTTGGGTGTGTTTGGNNNNNNGG и 5’-TGTGTTGGGTGTGTTTGGNNNNNNTTT, а на втором этапе полимеразной цепной реакции ограничились использованием праймера на основе конститутивной части 5’-TGTGTTGGGTGTGTTTGG. В работе приведены условия реакции и сравнение использования различных полимераз, а также их сочетаний. Показана возможность применения для первого этапа комбинации полимераз Bst и Pfu в присутствии 10 мМ ионов магния, а также выявлен потенциал для использования полимеразы Klentaq1, несущей замену D732N, для развития методов полногеномной амплификации. Продемонстрировано, что предложенный метод позволяет масштабировать исходное предельно малое количество ДНК для получения образца, пригодного для анализа методом массового параллельного секвенирования (секвенирование нового поколения, next generation sequencing, NGS) с применением стандартных коммерческих протоколов интерпретации данных.

Библиографические ссылки

ЛИТЕРАТУРА

Сайфитдинова, А. Ф. (2014) Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. 3-е изд. СПб.: Свое издательство, 110 с.

Aliotta, J. M., Pelletier, J. J., Ware, J. L. et al. (1996) Thermostable Bst DNA polymerase I lacks a 3’→5’ proofreading exonuclease activity. Genetic Analysis: Biomolecular Engineering, vol. 12, no. 5–6, pp. 185–195. https://doi.org/10.1016/S1050-3862(96)80005-2

Aviel-Ronen, S., Qi Zhu, C., Coe, B. P. et al. (2006) Large fragment Bst DNA polymerase for whole genome amplification of DNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissues. BMC Genomics, vol. 7, no. 1, article 312. https://doi.org/10.1186/1471-2164-7-312

Barnes, W. M., Zhang, Z., Kermekchiev, M. B. (2021) A single amino acid change to Taq DNA polymerase enables faster PCR, reverse transcription and strand-displacement. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, vol. 8, article 553474. https://doi.org/10.3389/fbioe.2020.553474

Blanco, L., Bernad, A., Lázaro, J. M. et al (1989) Highly efficient DNA synthesis by the phage φ29 DNA polymerase: Symmetrical mode of DNA replication. The Journal of Biological Chemistry, vol. 264, no. 15, pp. 8935–8940. https://doi.org/10.1016/S0021-9258(18)81883-X

Klenow, H., Henningsen, I. (1970) Selective elimination of the exonuclease activity of the deoxyribonucleic acid polymerase from Escherichia coli B by limited proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 65, no. 1, pp. 168–175. https://doi.org/10.1073/pnas.65.1.168

Linck, L, Resch-Genger, U. (2010) Identification of efficient fluorophores for the direct labeling of DNA via rolling circle amplification (RCA) polymerase φ29. European Journal of Medicinal Chemistry, vol. 45, no. 12, pp. 5561– 5566. https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2010.09.005

Lundberg, K. S., Shoemaker, D. D., Adams, M. W. W. et al. (1991) High-fidelity amplification using a thermostable DNA polymerase isolated from Pyrococcus furiosus. Gene, vol. 108, no. 1, pp. 1–6. https://doi.org/10.1016/0378-1119(91)90480-Y

Olszewski, M., Śpibida, M., Bilek, M., Krawczyk, B. (2017) Fusion of Taq DNA polymerase with single-stranded DNA binding-like protein of Nanoarchaeum equitans — Expression and characterization. PLoS ONE, vol. 12, no. 9, article e0184162. http://doi.org/10.1371/journal.pone.0184162

Oscorbin, I. P., Boyarskikh, U. A., Filipenko, M. L. (2015) Large fragment of DNA polymerase I from Geobacillus sp. 777: Cloning and comparison with DNA polymerases I in practical applications. Molecular Biotechnology, vol. 57, no. 10, pp. 947–959. https://doi.org/10.1007/s12033-015-9886-x

Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S. et al. (1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, vol. 239, no. 4839, pp. 487–491. https://doi.org/10.1126/science.2448875

Telenius, H., Carter, N. P., Bebb, C. E. et al. (1992) Degenerate oligonucleotide-primed PCR: General amplification of target DNA by a single degenerate primer. Genomics, vol. 13, no. 3, pp. 718–725. https://doi.org/10.1016/0888-7543(92)90147-K

Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. (2012) Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell. Science, vol. 338, no. 6114, pp. 1622–1626. https://doi.org/10.1126/science.1229164

REFERENCES

Aliotta, J. M., Pelletier, J. J., Ware, J. L. et al. (1996) Thermostable Bst DNA polymerase I lacks a 3’→5’ proofreading exonuclease activity. Genetic Analysis: Biomolecular Engineering, vol. 12, no. 5–6, pp. 185–195. https://doi.org/10.1016/S1050-3862(96)80005-2 (In English)

Aviel-Ronen, S., Qi Zhu, C., Coe, B. P. et al. (2006) Large fragment Bst DNA polymerase for whole genome amplification of DNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissues. BMC Genomics, vol. 7, no. 1, article 312. https://doi.org/10.1186/1471-2164-7-312 (In English)

Barnes, W. M., Zhang, Z., Kermekchiev, M. B. (2021) A single amino acid change to Taq DNA polymerase enables faster PCR, reverse transcription and strand-displacement. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, vol. 8, article 553474. https://doi.org/10.3389/fbioe.2020.553474 (In English)

Blanco, L., Bernad, A., Lázaro, J. M. et al (1989) Highly efficient DNA synthesis by the phage φ29 DNA polymerase: Symmetrical mode of DNA replication. The Journal of Biological Chemistry, vol. 264, no. 15, pp. 8935–8940. https://doi.org/10.1016/S0021-9258(18)81883-X (In English)

Klenow, H., Henningsen, I. (1970) Selective elimination of the exonuclease activity of the deoxyribonucleic acid polymerase from Escherichia coli B by limited proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 65, no. 1, pp. 168–175. https://doi.org/10.1073/pnas.65.1.168 (In English)

Linck, L, Resch-Genger, U. (2010) Identification of efficient fluorophores for the direct labeling of DNA via rolling circle amplification (RCA) polymerase φ29. European Journal of Medicinal Chemistry, vol. 45, no. 12, pp. 5561– 5566. https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2010.09.005 (In English)

Lundberg, K. S., Shoemaker, D. D., Adams, M. W. W. et al. (1991) High-fidelity amplification using a thermostable DNA polymerase isolated from Pyrococcus furiosus. Gene, vol. 108, no. 1, pp. 1–6. https://doi.org/10.1016/0378-1119(91)90480-Y (In English)

Olszewski, M., Śpibida, M., Bilek, M., Krawczyk, B. (2017) Fusion of Taq DNA polymerase with single-stranded DNA binding-like protein of Nanoarchaeum equitans — Expression and characterization. PLoS ONE, vol. 12, no. 9, article e0184162. http://doi.org/10.1371/journal.pone.0184162 (In English)

Oscorbin, I. P., Boyarskikh, U. A., Filipenko, M. L. (2015) Large fragment of DNA polymerase I from Geobacillus sp. 777: Cloning and comparison with DNA polymerases I in practical applications. Molecular Biotechnology, vol. 57, no. 10, pp. 947–959. https://doi.org/10.1007/s12033-015-9886-x (In English)

Saifitdinova, A. F. (2014) Dvumernaya fluorestsentnaya mikroskopiya dlya analiza biologicheskikh obraztsov [Two-dimensional fluorescence microscopy for the analysis of biological samples]. 3rd ed. Saint Petersburg: Svoe izdatel’stvo Publ., 110 p. (In Russian)

Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S. et al. (1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, vol. 239, no. 4839, pp. 487–491. https://doi.org/10.1126/science.2448875 (In English)

Telenius, H., Carter, N. P., Bebb, C. E. et al. (1992) Degenerate oligonucleotide-primed PCR: General amplification of target DNA by a single degenerate primer. Genomics, vol. 13, no. 3, pp. 718–725. https://doi.org/10.1016/0888-7543(92)90147-K (In English)

Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. (2012) Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell. Science, vol. 338, no. 6114, pp. 1622–1626. https://doi.org/10.1126/science.1229164 (In English)

Загрузки

Опубликован

31.10.2023

Выпуск

Том 4 № 3 (2023)

Раздел

Экспериментальные статьи

Лицензия

Copyright (c) 2024 Алсу Фаритовна Сайфитдинова, Ольга Андреевна Павлова, Андрей Андреевич Зелинский, Марина Владиславовна Рябинина, Олег Сергеевич Глотов, Денис Игоревич Богомаз, Александр Анатольевич Рубель

Лицензия Creative Commons

Это произведение доступно по лицензии Creative Commons «Attribution-NonCommercial» («Атрибуция — Некоммерческое использование») 4.0 Всемирная.

Автор предоставляет материалы на условиях публичной оферты и лицензии CC BY-NC 4.0. Эта лицензия позволяет неограниченному кругу лиц копировать и распространять материал на любом носителе и в любом формате, но с обязательным указанием авторства и только в некоммерческих целях. После публикации все статьи находятся в открытом доступе.

Авторы сохраняют авторские права на статью и могут использовать материалы опубликованной статьи при подготовке других публикаций, а также пользоваться печатными или электронными копиями статьи в научных, образовательных и иных целях. Право на номер журнала как составное произведение принадлежит издателю.